工艺技术

蛋白质被认为是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源，具有糖类和脂肪不可替代的作用。含氮量是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。

在检验食品中蛋白质时，通常是先检定出食品中的总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，以此得到蛋白质含量。

凯氏定氮法由 Kieldahl 于 1883 年首先提出，至今仍被作为标准检验方法。

凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定过程。

原理

向样品中加入浓硫酸和催化剂，充分混匀，然后加热消化分解，样品中碳和氢被氧化成二氧化碳和水，其中的有机氮转化为硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。

转换因子

转换因子是通过凯氏定氮法测得的氮换算为蛋白质的系数。理想状态下的蛋白质中的氮含量约为16%，所以测量值乘以6.25即为蛋白质量。下表为总结出的转换因子数值。

样品消化

浓硫酸具有脱水性和氧化性，可使有机物中的碳、氢被氧化为二氧化碳和水，蛋白质会分解为氨，然后氨与硫酸结合生成硫酸铵。通常加入硫酸钾和硫酸铜作为催化剂来加快蛋白质分解。硫酸钾可以提高溶液的沸点，一般情况下，纯硫酸的沸点在 340 ℃左右，但是在添加硫酸钾后，可提高至 400 ℃以上。提高温度使有机物加快分解。但是不能加入过多的硫酸钾，否则会因为温度过高，使生成的硫酸铵发生热分解成氨而造成损失。硫酸铜除作为催化剂外，还可以指示消化终点的到达，有机物全部消化完全后，溶液呈现清澈的蓝绿色，硫酸铜还可以做蒸馏时碱性反应的指示剂。

蒸馏

消化液中的硫酸铵在碱性环境下会转化成氨。为防止水中微量的氨气受热逸出，影响测定结果，所以水蒸气发生器中的水要保持酸性。硫酸铵是一种强酸弱碱盐，需要足够的碱液使结合态的氨完全反应并释放出来，这个过程中的氢氧化钠一定要过量，过量的氢氧化钠会与硫酸铜生成蓝色的氢氧化铜沉淀，氢氧化铜受热分解成黑色的氧化铜沉淀。检验蒸馏是否完成，可用奈氏试纸法，NH₄^＋或 NH₃遇奈氏试剂会反应生成棕红色的碘化汞铵化合物。

吸收

加热蒸馏放出的氨可用硼酸溶液吸收，硼酸有吸收氨的作用，又因其呈微弱酸性，不影响下一步滴定时指示剂的变色反应。温度过高会使硼酸吸收液对氨的吸收作用减弱，从而造成损失，故一般不超过 40 ℃。

NH₃+H₂BO₃=NH₃·H₃BO₃；

滴定

待吸收完全后，用硫酸或者盐酸标准溶液进行酸碱滴定，滴定液的浓度直接影响结果的准确性，必须按照要求进行配制和标定。混合指示剂在中性溶液中呈灰色，滴定终点时液体呈灰色。

NH₃·H₃BO₃+HCl= NH₄Cl+H₃BO₃。

注意事项

①所用的试剂溶液应用无氨蒸馏水配制；

②取样应具有代表性 , 取样前将样品充分混匀；

③样品称量放入凯氏烧瓶时，切勿使样品粘附在瓶颈部，避免样品未消化完全而造成氮损失；

④为了保证使烧瓶壁上的残渣消化完全，在消化过程中要不时地转动凯氏烧瓶；

⑤消化脂肪或糖含量较高的样品时，易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出，消化时应先消化加热并不断摇动，或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂；

⑥当样品消化液浑浊或未澄清透明时，可先将凯氏烧瓶放冷至室温后，再加入 30% 的过氧化氢，然后继续加热消化；

⑦加碱后，漏斗要进行水封，避免因装置漏气造成氨的逸出影响结果的准确性；

⑧要保证蒸馏装置不能漏气；

⑨在蒸馏时反应室与外界存在的压力差，蒸汽可将氨带出。故蒸馏时，要保证蒸汽均匀、充足，中间不能停止加热，防止发生倒吸；

⑩蒸馏前如果加碱后消化液呈蓝色而没有生成氢氧化铜沉淀，说明加入的碱量不足，需要适量补加碱；

蒸馏时为防止水蒸气发生器内液体爆沸，加入几片碎瓷片或大的玻璃珠，玻璃珠直径最好大于联通的玻璃管直径，以免玻璃珠进入玻璃管内影响蒸汽均匀、充足的输出；冷凝管下端要插入硼酸吸收液液面以下，防止氨逸出，蒸馏完毕后先将冷凝管下端提离液面，再蒸 1 min后清洗管口，再移开吸收瓶，最后关掉热源，否则可能发生倒吸。

结语

凯氏定氮法经典、准确，适用于食品中蛋白质的测定。但是因样品中一般会含有一些非蛋白质的含氮化合物，所以凯氏定氮法测定结果为样品中粗蛋白质含量。然而，此法实际上测的不是蛋白质含量，而是通过测氮含量来推算出样品中蛋白质的含量。

在凯氏定氮法中消化操作的条件是产生误差的主要原因，因此要格外注意。

在实际的生产实验中，每一步应该严格按照标准的规定来进行操作。本文为笔者日常工作实验总结所得，望对实验者有些许帮助。

2017年高考

凯氏定氮法是测定蛋白质中氮含量的经典方法，其原理是用浓硫酸在催化剂存在下将样品中有机氮转化成铵盐，利用如图所示装置处理铵盐，然后通过滴定测量。已知：NH₃＋H₂BO₃=NH₃·H₃BO₃；NH₃·H₃BO₃＋HCl= NH₄Cl＋H₃BO₃。

回答下列问题：

（1）a的作用是____________________。

（2）b中放入少量碎瓷片的目的是___________________。f的名称是_______________。

（3）清洗仪器：g中加蒸馏水；打开K₁，关闭K₂、K₃，加热b，蒸气充满管路；停止加热，关闭K₁，g中蒸馏水倒吸入c，原因是____________________；打开K₂放掉水。重复操作2～3次。

（4）仪器清洗后，g中加入硼酸（H₃BO₃）和指示剂。铵盐试样由d注入e，随后注入氢氧化钠溶液，用蒸馏水冲洗d，关闭K₃，d中保留少量水。打开K₁，加热b，使水蒸气进入e。

①d中保留少量水的目的是____________________

②e中主要反应的离子方程式为____________________。e采用中空双层玻璃瓶的作用是____________________。

（5）取某甘氨酸（C₂H₅NO₂）样品m克进行测定，滴定g中吸收时消耗浓度为c mol·L-1的盐酸V mL，则样品中氮的质量分数为_______%，样品的纯度≤______  %。

解析：本题考查实验方案设计与评价。蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。题给装置为定氮蒸馏装置，b为蒸汽发生瓶、c为汽水分离管、e为反应管使氨气完全蒸馏出来、g为氨气吸收装置。

（1）a管插入水中起安全瓶作用，若烧瓶内气压过高水会进入a管中维持压强平衡。

（2）b中放入少量碎瓷片的目的是防止暴沸，f的名称是直型冷凝管。

（3）清洗仪器时，停止加热，关闭K₁，c中水蒸气冷凝为水后，装置内气体压强小于外界大气压，在外界大气压的作用下，g中蒸馏水由e倒吸进入c中，起到清洗仪器的目的。

（4）d中保留少量水可以防止氨气逸出，也可以用PH试纸试馏出液是否为碱性检验氨是否完全蒸馏出来。e采用中空双层玻璃瓶的作用是减少热量损失，有利于铵根转化为氨气逸出。

（5）由题意可知甘氨酸中n（C₂H₃NO₂）=n（N）= n（HCl）=cV×10^-3mol，则样品中氮的质量分数为，样品的纯度≤。

答案：

（1）安全管，烧瓶内气压过大，水会进入a管中维持压强平衡

（2）防止暴沸  直型冷凝管

（3）c、e及其所连接的管道内水蒸气冷凝为水后，气压远小于外界大气压，在大气压的作用下，锥形瓶内的蒸馏水被倒吸入c中

（4）①防漏气，便于检验d氨是否完全蒸馏出来

②NH₄^＋＋OH^－NH₃↑＋H₂O，减少热量损失，有利于铵根转化为氨气逸出

（5）  ，